接上篇文：“《防腐剂与产品组分相容性研究（一）失灵的挑战性实验》”，广东省微生物研究所谢小保主任从化妆品微生物检验的特点、制样、流程、影响因素、以及可完善建议等多方面带领大家更深入了解微生物防腐体系以及防腐剂与产品组分之间的关系，引领企业积累及提升化妆品防腐剂的综合应用能力。

一、化妆品微生物检验 特点：

■ 剂型多

■ 需要加中和剂

■ 需要营养丰富的培养基

二、化妆品微生物检验 检样制备：

1、液体样品：

A、水溶性

量取10ml加到90ml灭菌生理盐水中，如样品少于10ml，如为5m则加45ml灭菌生理盐水，混匀后，制成1:10稀释液。

B、油溶性

取样品10ml，先加5ml灭菌液体石蜡混匀，再加10ml灭菌的吐温80，在42～44℃水浴中振荡混合10min，加入灭菌生理盐水75ml（在40～44℃水浴中预温），在40～44℃水浴中乳化，制成1:10的悬液， 分散混悬后，放30～32℃。

2、膏、霜、乳剂样品：

A、水溶性

称取10g，加到灭菌的带玻璃珠加有90ml灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振荡混匀，放32℃水浴静置15min，用其上清液作为1:10稀释。

B、油溶性

称取10g，放到灭菌的研钵中，加10ml灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加10ml灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70ml灭菌生理盐水，在40～44℃水浴中充分混合，制成1:10稀释液。

3、固体样品：

称取10g，加到灭菌的生理盐水稀释瓶中，振荡混匀，是其分散混悬后，放在30～32℃水浴中15min后取出，充分振荡混合，再放到放在30～32℃水浴中静置15min，取上清液作为1:10稀释液。

注：如有均质器，上述水溶性膏、霜、乳剂等，可称10g样品加90ml灭菌生理盐水，均质1～2min，疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10g 样品，加10mL灭菌液体石蜡，10mL 吐温80，70mL 灭菌生理盐水，均质3min～5min。

三、化妆品微生物检验 检测流程：

1、菌落总数检测程序

2、霉菌、酵母菌检测程序：

3、耐热大肠杆菌检测程序：

4、铜绿假单胞菌：

 5、金黄色葡萄球菌检测程序

四、化妆品幑生物检测影响因素：

1培养基

1、培养基的质量对菌落总数、霉菌与酵母数检测结果有较大影响。

2、不同企业生产的培养基质量有差异，影响检测结果。

3、不同企业生产的培养基对于质控菌的检测差异不明显。

生理盐水没有中和作用，建议改为具有中和作用的稀释液。

如：SCDLP，MLB

2、TTC

实验方法：未加入防腐剂的化妆品，放置10天后，再测试化妆品的菌落总数，采用加入TTC(2 ,3 ,5 - 氯化三苯基四氮唑)和不加TTC的卵磷脂、吐温80—营养琼脂培养基进行检测， 培养基中TTC含量按《化妆品卫生规范》规定加入。

结果表明，培养基中加入TTC和不加TTC，检测结果存在较大的差异，膏霜类产品检测结果相差66倍，浴液类产品相差2倍，乳液类产品结果相同，这说明TTC对于产品中的部分自然菌有一定的抑制作用，并对产品中不同种类的细菌抑菌活性不同。

原因分析：TTC影响细菌的生长速度；TTC完全抑制了部分细菌的生长。本实验室曾对放置过夜的生产用水进行过同样的调查，发现未加入TTC和加入TTC的检测结果最高相差100倍。

在未加入防腐剂的化妆品中加入金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌进行实验，未加入TTC和加入TTC的检测结果相同，说明TTC对质控菌没有抑制作用，因此，根据质控菌测试的结果评价菌落总数检测方法的有效性有一定的局限性。由于原材料和水中的微生物种类非常多，每种菌对TTC的敏感性不同，造成TTC对不同的化妆品检测结果的影响存在差异。  

3、中和剂

实验方法：在添加质控菌的实验中,使用20种化妆品试样，其中膏霜类6种，浴液类6种,乳液类8种，这些化妆品都含有防腐剂，菌落总数按《化妆品卫生规范》规定进行，实验结果见下表。 

从结果可以看出，稀释10倍时，平板上没有菌落生长，说明化妆品中防腐剂抑制了细菌的生长，常规检测法中的卵磷脂和吐温80没有完全中和防腐剂的抑菌性能，稀释100倍时，膏霜类还有两种化妆品没有检出添加的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，说明这两种化妆品中的防腐剂还具有抑菌作用，其它品牌的化妆品则菌落大量生长，说明在100倍的条件下，防腐剂对添加的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌没有抑菌作用。因此，两种膏霜类化妆品的检出限大于100cfu/g,其它种类的化妆品的检出限大于100cfu/g。

4、中和剂对添加质控菌检出限的影响 

从结果可以看出，加入了中和剂后，检出限为≤10 cfu/g，说明中和剂已经完全消除了防腐剂的抑菌性能，检测结果更加准确。《化妆品卫生规范》中检测菌落总数用含卵磷脂、吐温80的营养琼脂培养基，由于卵磷脂、吐温80对卡松类的防腐剂的中和效果有限，造成检测限偏高，检测结果不准确，而在稀释液中加入中和剂，可中和防腐剂的抑菌效果，因此，检测时加入中和剂，可提高检测灵敏度。

五、可改进项

1、 中和剂的选择

化妆品通常添加了防腐剂,《化妆品卫生规范》选用吐温- 80和卵磷脂配合作为中和剂，但该中和剂消除防腐剂的效果有限，对于多数化妆品只能降低部分防腐剂的效果，因此，对于化妆品的微生物检测需要了解化妆品中加入防腐剂的种类，而对于不同防腐剂，需要根据中和剂鉴定试验来评价中和剂的效果 。

2、TTC的影响 

虽然可以使菌落变红色，有利于菌落计数，但不同产品中的细菌对于TTC的敏感性不同，TTC的加入对产品中菌落总数的检测结果影响很大，因此，一般情况下，建议不加TTC，如果化妆品中的颗粒影响计数，不得不加入TTC，建议减少TTC的含量，至于加入TTC的具体浓度,还有待于进一步探讨。

3、 稀释液

建议将生理盐水改为SCDLP或相应的中和液。

4、 培养基的选择

菌落总数培养基，增加胰蛋白胨。

霉菌和酵母菌培养基，在虎红（孟加拉红）培养基基础上增加卵磷脂和吐温80，进一步中和防腐剂的抑菌作用。

5 增加方法有效性验证试验

化妆品中微生物检测方法的有效性判断极其重要，如果检测方法不完善，可能导致检测结果不准确，这对于产品的安全性和消费者的身体健康都会带来潜在的危害。在膏霜类化妆品中，微生物都是吸附或附着于颗粒状的原料中，检测时不易洗脱下来，因此，需要验证检测方法的有效性，可通过添加标标准菌的方法验证，参考有关行业的标准和本试验结果，建议以加标菌回收率至少达到70%作为检测方法有效性的标准。

综上，在化妆品检验过程中仍会出现检不出菌，或者未检出仍然发生腐坏的现象，未检出≠无菌，无菌≠不发生腐坏，具体操作仍需要考虑体系的配伍性、微生物特异性以及是否严格做了3个稀释度仍未检出……

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